สิ่งที่ควรทำและไม่ควรทำในการทดสอบโมเลกุล

วิธีการตรวจจับโมเลกุลสามารถผลิตกรดนิวคลีอิกในปริมาณมากได้โดยการขยายปริมาณกรดนิวคลีอิกที่พบในตัวอย่าง แม้ว่าจะมีประโยชน์ในการตรวจจับที่ละเอียดอ่อน แต่ก็อาจทำให้เกิดการปนเปื้อนได้เนื่องจากการแพร่กระจายของละอองขยายในสภาพแวดล้อมของห้องปฏิบัติการ เมื่อทำการทดลอง สามารถดำเนินการเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของสารเคมี อุปกรณ์ห้องปฏิบัติการ และพื้นที่โต๊ะทำงาน เนื่องจากการปนเปื้อนดังกล่าวอาจทำให้เกิดผลบวกปลอม (หรือลบปลอม)

เพื่อช่วยลดโอกาสการปนเปื้อน ควรปฏิบัติตามหลักปฏิบัติที่ดีของห้องปฏิบัติการอยู่เสมอ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ควรใช้ความระมัดระวังในประเด็นต่อไปนี้:

1. การจัดการสารเคมี
2. การจัดวางสถานที่ทำงานและอุปกรณ์
3. คำแนะนำการใช้และการทำความสะอาดสำหรับพื้นที่โมเลกุลที่กำหนด
4. คำแนะนำทั่วไปเกี่ยวกับชีววิทยาโมเลกุล
5. การควบคุมภายใน
6. บรรณานุกรม

1. การจัดการสารเคมี

ปั่นหลอดรีเอเจนต์สั้นๆ ก่อนเปิดเพื่อหลีกเลี่ยงการเกิดละอองลอย แบ่งรีเอเจนต์เป็นส่วนๆ เพื่อหลีกเลี่ยงการเกิดการแช่แข็งและละลายหลายครั้งและการปนเปื้อนของสารตั้งต้นหลัก ติดฉลากและระบุวันที่หลอดรีเอเจนต์และปฏิกิริยาทั้งหมดอย่างชัดเจน และบันทึกหมายเลขล็อตและชุดรีเอเจนต์ที่ใช้ในทุกการทดลอง ปิเปตรีเอเจนต์และตัวอย่างทั้งหมดโดยใช้หัวกรอง ก่อนซื้อ ควรยืนยันกับผู้ผลิตว่าหัวกรองเหมาะกับยี่ห้อของปิเปตที่จะใช้หรือไม่

2. การจัดวางสถานที่ทำงานและอุปกรณ์

ควรจัดพื้นที่ทำงานให้เป็นระเบียบเพื่อให้แน่ใจว่างานไหลไปในทิศทางเดียวกัน ตั้งแต่บริเวณที่สะอาด (ก่อนทำ PCR) ไปจนถึงบริเวณที่สกปรก (หลังทำ PCR) ข้อควรระวังทั่วไปต่อไปนี้จะช่วยลดโอกาสการปนเปื้อนได้ จัดให้มีห้องที่กำหนดแยกกัน หรืออย่างน้อยต้องมีพื้นที่แยกกันทางกายภาพ สำหรับการเตรียมมาสเตอร์มิกซ์ การสกัดกรดนิวคลีอิกและการเติมเทมเพลต DNA การขยายพันธุ์และการจัดการผลิตภัณฑ์ที่ขยายพันธุ์ และการวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ เช่น การวิเคราะห์ด้วยอิเล็กโทรโฟรีซิสด้วยเจล

ในบางสถานที่ การมีห้องแยกกัน 4 ห้องเป็นเรื่องยาก ทางเลือกที่เป็นไปได้แต่ไม่ค่อยน่าต้องการคือการเตรียมมาสเตอร์มิกซ์ในพื้นที่กักเก็บ เช่น ตู้ไหลแบบลามินาร์ ในกรณีของการขยาย PCR แบบซ้อน การเตรียมมาสเตอร์มิกซ์สำหรับปฏิกิริยารอบที่สองควรเตรียมในพื้นที่ "สะอาด" สำหรับการเตรียมมาสเตอร์มิกซ์ แต่การเพาะเชื้อด้วยผลิตภัณฑ์ PCR หลักควรทำในห้องขยายพันธุ์ และหากเป็นไปได้ ในพื้นที่กักเก็บเฉพาะ (เช่น ตู้ไหลแบบลามินาร์)

แต่ละห้อง/พื้นที่ต้องมีปิเปตที่ติดฉลากไว้อย่างชัดเจน ปลายกรอง ชั้นวางหลอดทดลอง วอร์เท็กซ์ เครื่องเหวี่ยง (ถ้ามี) ปากกา น้ำยาสำหรับห้องปฏิบัติการทั่วไป เสื้อคลุมห้องปฏิบัติการ และกล่องถุงมือที่จะถูกเก็บไว้ที่สถานีงานที่เกี่ยวข้อง ต้องล้างมือและเปลี่ยนถุงมือและเสื้อคลุมห้องปฏิบัติการเมื่อเคลื่อนย้ายระหว่างพื้นที่ที่กำหนด ไม่ควรเคลื่อนย้ายน้ำยาและอุปกรณ์จากพื้นที่สกปรกไปยังพื้นที่สะอาด หากเกิดกรณีร้ายแรงที่จำเป็นต้องเคลื่อนย้ายน้ำยาหรืออุปกรณ์ชิ้นหนึ่งไปด้านหลัง จะต้องฆ่าเชื้อด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 10% ก่อน จากนั้นจึงเช็ดด้วยน้ำที่ผ่านการฆ่าเชื้อ

บันทึก

ต้องเตรียมสารละลายโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 10% ใหม่ทุกวัน เมื่อใช้ในการฆ่าเชื้อ ควรปฏิบัติตามระยะเวลาสัมผัสขั้นต่ำ 10 นาที
นอกจากนี้ สามารถใช้ผลิตภัณฑ์ที่มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ซึ่งได้รับการตรวจรับรองว่าเป็นสารฆ่าเชื้อพื้นผิวที่ทำลาย DNA ได้ หากคำแนะนำด้านความปลอดภัยในพื้นที่ไม่อนุญาตให้ใช้โซเดียมไฮโปคลอไรต์ หรือหากโซเดียมไฮโปคลอไรต์ไม่เหมาะสมสำหรับการกำจัดสารปนเปื้อนในส่วนโลหะของอุปกรณ์

ในทางอุดมคติ พนักงานควรปฏิบัติตามแนวทางเวิร์กโฟลว์แบบทิศทางเดียว และไม่ย้ายจากบริเวณที่สกปรก (หลังการทำ PCR) กลับไปยังบริเวณที่สะอาด (ก่อนการทำ PCR) ในวันเดียวกัน อย่างไรก็ตาม อาจมีบางครั้งที่สิ่งนี้หลีกเลี่ยงไม่ได้ เมื่อเกิดเหตุการณ์ดังกล่าวขึ้น พนักงานจะต้องล้างมือให้สะอาด เปลี่ยนถุงมือ ใช้เสื้อคลุมแล็บที่กำหนดให้ และอย่านำอุปกรณ์ใดๆ ที่ต้องการนำออกจากห้องอีก เช่น หนังสือแล็บ ควรเน้นย้ำมาตรการควบคุมดังกล่าวในการฝึกอบรมพนักงานเกี่ยวกับวิธีการทางโมเลกุล

หลังการใช้งาน ควรทำความสะอาดโต๊ะทำงานด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 10% (ตามด้วยน้ำปราศจากเชื้อเพื่อขจัดสารฟอกขาวที่ตกค้าง) เอธานอล 70% หรือสารฆ่าเชื้อที่ทำลาย DNA ที่ได้รับการรับรองซึ่งมีวางจำหน่ายในท้องตลาด โดยควรติดตั้งหลอดไฟอัลตราไวโอเลต (UV) เพื่อให้สามารถฆ่าเชื้อได้ด้วยการฉายรังสี อย่างไรก็ตาม ควรจำกัดการใช้หลอดไฟ UV ในพื้นที่ทำงานที่ปิด เช่น ตู้เซฟ เพื่อจำกัดการสัมผัสแสง UV ของเจ้าหน้าที่ห้องปฏิบัติการ โปรดปฏิบัติตามคำแนะนำของผู้ผลิตเกี่ยวกับการดูแล การระบายอากาศ และการทำความสะอาดหลอดไฟ UV เพื่อให้แน่ใจว่าหลอดไฟยังคงมีประสิทธิภาพ

หากใช้เอธานอล 70% แทนโซเดียมไฮโปคลอไรต์ จะต้องฉายแสง UV เพื่อทำการฆ่าเชื้อให้เสร็จสมบูรณ์
ห้ามทำความสะอาดวอร์เท็กซ์และเครื่องเหวี่ยงด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ แต่ให้ใช้เอธานอล 70% เช็ดแล้วให้โดนแสง UV หรือใช้สารฆ่าเชื้อ DNA เชิงพาณิชย์ สำหรับของเหลวที่หก ให้สอบถามคำแนะนำในการทำความสะอาดเพิ่มเติมจากผู้ผลิต หากคำแนะนำของผู้ผลิตอนุญาต ควรฆ่าเชื้อปิเปตด้วยหม้ออัดไอน้ำเป็นประจำ หากไม่สามารถฆ่าเชื้อปิเปตด้วยหม้ออัดไอน้ำได้ ก็ควรทำความสะอาดด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 10% (แล้วเช็ดให้สะอาดด้วยน้ำที่ผ่านการฆ่าเชื้อ) หรือสารฆ่าเชื้อ DNA เชิงพาณิชย์ แล้วจึงโดนแสง UV

การทำความสะอาดด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ที่มีเปอร์เซ็นต์สูงอาจทำให้พลาสติกและโลหะของปิเปตเสียหายได้ในที่สุด หากทำเป็นประจำ ตรวจสอบคำแนะนำจากผู้ผลิตก่อน อุปกรณ์ทั้งหมดต้องได้รับการปรับเทียบอย่างสม่ำเสมอตามตารางเวลาที่ผู้ผลิตแนะนำ ควรมีบุคลากรที่ได้รับมอบหมายให้รับผิดชอบในการดูแลให้ปฏิบัติตามตารางเวลาการปรับเทียบ บันทึกรายละเอียด และแสดงฉลากบริการบนอุปกรณ์อย่างชัดเจน

3. คำแนะนำการใช้และการทำความสะอาดสำหรับพื้นที่โมเลกุลที่กำหนด

ก่อนทำ PCR: การเตรียมส่วนผสมรีเอเจนต์/มาสเตอร์มิกซ์: ควรเป็นพื้นที่ที่สะอาดที่สุดจากพื้นที่ทั้งหมดที่ใช้สำหรับการเตรียมการทดลองทางโมเลกุล และควรเป็นตู้ลามินาร์โฟลว์ที่กำหนดให้พร้อมติดตั้งไฟ UV ห้ามจัดการตัวอย่าง กรดนิวคลีอิกที่สกัด และผลิตภัณฑ์ PCR ที่ขยายแล้วในบริเวณนี้ ควรเก็บรีเอเจนต์ขยายไว้ในช่องแช่แข็ง (หรือตู้เย็น ตามคำแนะนำของผู้ผลิต) ในพื้นที่ที่กำหนดไว้เดียวกัน โดยควรอยู่ติดกับตู้ลามินาร์โฟลว์หรือบริเวณก่อนทำ PCR ควรเปลี่ยนถุงมือทุกครั้งที่เข้าไปในบริเวณก่อนทำ PCR หรือตู้ลามินาร์โฟลว์

ควรทำความสะอาดพื้นที่ก่อนทำ PCR หรือตู้ลามินาร์โฟลว์ก่อนและหลังใช้งานดังนี้ เช็ดสิ่งของทั้งหมดในตู้ เช่น ปิเปต กล่องทิป วอร์เท็กซ์ เครื่องเหวี่ยง ชั้นวางหลอดทดลอง ปากกา ฯลฯ ด้วยเอธานอล 70% หรือสารฆ่าเชื้อทำลาย DNA เชิงพาณิชย์ แล้วปล่อยให้แห้ง ในกรณีที่เป็นพื้นที่ทำงานแบบปิด เช่น ตู้ลามินาร์โฟลว์ ให้ฉายแสง UV บนเครื่องดูดควันเป็นเวลา 30 นาที

บันทึก

อย่าให้สารเคมีสัมผัสกับแสง UV ให้ย้ายสารเคมีเข้าไปในตู้เมื่อทำความสะอาดแล้วเท่านั้น หากจะทำปฏิกิริยารีดักชัน PCR ย้อนกลับ อาจช่วยได้หากเช็ดพื้นผิวและอุปกรณ์ด้วยสารละลายที่ทำลาย RNases เมื่อสัมผัส ซึ่งอาจช่วยหลีกเลี่ยงผลลบเทียมจากการย่อยสลาย RNA ด้วยเอนไซม์ หลังจากขจัดสารปนเปื้อนและก่อนเตรียมมาสเตอร์มิกซ์ ควรเปลี่ยนถุงมืออีกครั้ง จากนั้นตู้ก็พร้อมใช้งาน

Pre-PCR: การสกัดกรดนิวคลีอิก/การเติมเทมเพลต:

กรดนิวคลีอิกจะต้องถูกสกัดและจัดการในพื้นที่ที่กำหนดเป็นพื้นที่ที่สอง โดยใช้ปิเปต ปลายกรอง ชั้นวางหลอดทดลอง ถุงมือใหม่ เสื้อคลุมแล็บ และอุปกรณ์อื่นๆ พื้นที่นี้ยังใช้สำหรับเพิ่มเทมเพลต ตัวควบคุม และเส้นแนวโน้มลงในหลอดทดลองหรือแผ่นมาสเตอร์มิกซ์ เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของตัวอย่างกรดนิวคลีอิกที่สกัดออกมาซึ่งกำลังวิเคราะห์ ขอแนะนำให้เปลี่ยนถุงมือก่อนจัดการกับตัวควบคุมเชิงบวกหรือมาตรฐาน และใช้ปิเปตชุดแยกต่างหาก ห้ามปิเปตรีเอเจนต์ PCR และผลิตภัณฑ์ที่ขยายแล้วในพื้นที่นี้ ควรเก็บตัวอย่างในตู้เย็นหรือช่องแช่แข็งที่กำหนดในพื้นที่เดียวกัน ควรทำความสะอาดพื้นที่ทำงานของตัวอย่างในลักษณะเดียวกับพื้นที่มาสเตอร์มิกซ์

Post-PCR: การขยายและการจัดการผลิตภัณฑ์ที่ขยาย

พื้นที่ที่กำหนดไว้สำหรับกระบวนการขยายสัญญาณภายหลังและควรแยกออกจากพื้นที่ก่อนการทำ PCR โดยทั่วไปจะมีเครื่องเทอร์โมไซเคิลและแพลตฟอร์มแบบเรียลไทม์ และควรมีตู้ไหลแบบลามินาร์สำหรับเติมผลิตภัณฑ์ PCR รอบที่ 1 ลงในปฏิกิริยารอบที่ 2 หากมีการทำ PCR แบบซ้อน ห้ามจัดการรีเอเจนต์ PCR และกรดนิวคลีอิกที่สกัดได้ในพื้นที่นี้เนื่องจากมีความเสี่ยงต่อการปนเปื้อนสูง พื้นที่นี้ควรมีถุงมือ เสื้อคลุมแล็บ ชั้นวางจานและหลอดทดลอง ปิเปต ปลายกรอง ถัง และอุปกรณ์อื่นๆ แยกกัน ต้องปั่นหลอดทดลองก่อนเปิด ควรทำความสะอาดพื้นที่ทำงานของตัวอย่างในลักษณะเดียวกับพื้นที่มาสเตอร์มิกซ์

Post-PCR: การวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์

ห้องนี้ใช้สำหรับอุปกรณ์ตรวจจับผลิตภัณฑ์ เช่น ถังอิเล็กโตรโฟรีซิสแบบเจล ชุดจ่ายไฟ เครื่องฉายแสงยูวี และระบบบันทึกข้อมูลเจล พื้นที่นี้ควรมีถุงมือ เสื้อคลุมแล็บ ชั้นวางจานและหลอดทดลอง ปิเปต ปลายกรอง ถัง และอุปกรณ์อื่นๆ แยกกัน ห้ามนำสารเคมีชนิดอื่นเข้ามาในพื้นที่นี้ ยกเว้นสีย้อมสำหรับโหลด เครื่องหมายโมเลกุล เจลอะกาโรส และส่วนประกอบบัฟเฟอร์ ควรทำความสะอาดพื้นที่ทำงานของตัวอย่างในลักษณะเดียวกับพื้นที่มาสเตอร์มิกซ์

หมายเหตุสำคัญ

หากเป็นไปได้ ไม่ควรเข้าห้องก่อนการทำ PCR ในวันเดียวกัน หากมีการทำงานในห้องหลังการทำ PCR ไปแล้ว หากหลีกเลี่ยงไม่ได้ ให้ล้างมือให้สะอาดก่อน และสวมเสื้อคลุมแล็บเฉพาะในห้อง ห้ามนำหนังสือและเอกสารแล็บเข้าไปในห้องก่อนการทำ PCR หากใช้ในห้องหลังการทำ PCR หากจำเป็น ให้พิมพ์สำเนาโปรโตคอล/รหัสตัวอย่าง ฯลฯ

4. คำแนะนำทั่วไปเกี่ยวกับชีววิทยาโมเลกุล

สวมถุงมือชนิดไม่มีแป้งเพื่อหลีกเลี่ยงการยับยั้งการทดสอบ เทคนิคการปิเปตที่ถูกต้องมีความสำคัญอย่างยิ่งในการลดการปนเปื้อน การปิเปตที่ไม่ถูกต้องอาจส่งผลให้เกิดการกระเซ็นเมื่อจ่ายของเหลวและเกิดละอองลอย แนวทางปฏิบัติที่ดีในการปิเปตอย่างถูกต้องสามารถดูได้จากลิงก์ต่อไปนี้: คำแนะนำการปิเปตของ Gilson, วิดีโอเกี่ยวกับเทคนิคการปิเปตของ Anachem, หลอดเหวี่ยงก่อนเปิด และเปิดอย่างระมัดระวังเพื่อหลีกเลี่ยงการกระเซ็น ปิดหลอดทันทีหลังใช้งานเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อน

เมื่อทำปฏิกิริยาหลายอย่าง ให้เตรียมมาสเตอร์มิกซ์หนึ่งอันที่มีรีเอเจนต์ทั่วไป (เช่น น้ำ dNTP บัฟเฟอร์ ไพรเมอร์ และเอนไซม์) เพื่อลดจำนวนการถ่ายโอนรีเอเจนต์และลดภัยคุกคามจากการปนเปื้อน แนะนำให้ตั้งมาสเตอร์มิกซ์บนน้ำแข็งหรือบล็อกเย็น การใช้เอนไซม์ Hot Start อาจช่วยลดการผลิตผลิตภัณฑ์ที่ไม่จำเพาะได้ ปกป้องรีเอเจนต์ที่มีโพรบเรืองแสงจากแสงเพื่อหลีกเลี่ยงการเสื่อมสภาพ

5. การควบคุมภายใน

รวมการควบคุมเชิงบวกและเชิงลบที่ได้รับการยืนยันและมีลักษณะเฉพาะ รวมถึงการควบคุมแบบไม่มีเทมเพลตในปฏิกิริยาทั้งหมด และเส้นแนวโน้มไทเทรตหลายจุดสำหรับปฏิกิริยาเชิงปริมาณ การควบคุมเชิงบวกไม่ควรแข็งแกร่งจนก่อให้เกิดความเสี่ยงต่อการปนเปื้อน รวมการควบคุมการสกัดเชิงบวกและเชิงลบเมื่อทำการสกัดกรดนิวคลีอิก

ขอแนะนำให้ติดคำแนะนำที่ชัดเจนไว้ในแต่ละพื้นที่เพื่อให้ผู้ใช้ทราบกฎเกณฑ์การปฏิบัติตน ห้องปฏิบัติการวินิจฉัยที่ตรวจพบ DNA หรือ RNA ในระดับต่ำมากในตัวอย่างทางคลินิกอาจต้องใช้มาตรการรักษาความปลอดภัยเพิ่มเติมโดยมีระบบจัดการอากาศแยกกัน โดยมีแรงดันอากาศบวกเล็กน้อยในห้องก่อนทำ PCR และแรงดันอากาศลบเล็กน้อยในห้องหลังทำ PCR

สุดท้าย การพัฒนาแผนการประกันคุณภาพ (QA) จะเป็นประโยชน์ แผนดังกล่าวควรมีรายการสต๊อกสารเคมีหลักและสต๊อกสารเคมีสำรอง กฎเกณฑ์ในการจัดเก็บชุดอุปกรณ์และสารเคมี การรายงานผลการควบคุม โปรแกรมการฝึกอบรมพนักงาน อัลกอริทึมการแก้ไขปัญหา และการดำเนินการแก้ไขเมื่อจำเป็น

6. บรรณานุกรม

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. บทที่ 3: การจัดตั้งห้องปฏิบัติการ qPCR เอกสารแนะนำสำหรับการทดสอบแหล่งน้ำเพื่อการพักผ่อนหย่อนใจโดยใช้ USEPA qPCR 1611 มหาวิทยาลัย Lansing- Michigan State

Public Health England, NHS มาตรฐานของสหราชอาณาจักรสำหรับการตรวจสอบจุลชีววิทยา: แนวปฏิบัติที่ดีของห้องปฏิบัติการเมื่อทำการทดสอบการขยายโมเลกุล) คำแนะนำด้านคุณภาพ 2013;4(4):1–15

Mifflin T. การจัดตั้งห้องปฏิบัติการ PCR Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.

Schroeder S 2013. การบำรุงรักษาเครื่องเหวี่ยงตามปกติ: การทำความสะอาด การบำรุงรักษา และการฆ่าเชื้อเครื่องเหวี่ยง โรเตอร์ และอะแดปเตอร์ (เอกสารเผยแพร่ฉบับที่ 14) ฮัมบูร์ก: Eppendorf; 2013.

Viana RV, Wallis CL. Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) สำหรับการทดสอบตามโมเลกุลที่ใช้ในห้องปฏิบัติการวินิจฉัยโรค ใน: Akyar I, บรรณาธิการ. การควบคุมคุณภาพในขอบเขตกว้าง ริเยกา โครเอเชีย: Intech; 2011: 29–52