สิ่งที่ควรทำและไม่ควรทำสำหรับการทดสอบโมเลกุล

วิธีการตรวจจับระดับโมเลกุลสามารถผลิตกรดนิวคลีอิกปริมาณมากได้โดยการเพิ่มปริมาณสารตกค้างที่พบในตัวอย่าง แม้ว่าวิธีนี้จะมีประโยชน์ในการตรวจจับที่ไวต่อแสง แต่ก็อาจทำให้เกิดการปนเปื้อนจากการแพร่กระจายของละอองลอยในห้องปฏิบัติการได้ เมื่อทำการทดลอง อาจมีมาตรการป้องกันการปนเปื้อนของรีเอเจนต์ อุปกรณ์ห้องปฏิบัติการ และห้องปฏิบัติการ เนื่องจากการปนเปื้อนดังกล่าวอาจทำให้เกิดผลบวกลวง (หรือลบลวง) ได้

เพื่อช่วยลดโอกาสการปนเปื้อน ควรปฏิบัติตามหลักปฏิบัติที่ดีของห้องปฏิบัติการอยู่เสมอ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ควรใช้ความระมัดระวังในประเด็นต่อไปนี้:

1. การจัดการสารเคมี
2. การจัดวางพื้นที่ทำงานและอุปกรณ์
3. คำแนะนำการใช้และการทำความสะอาดสำหรับพื้นที่โมเลกุลที่กำหนด
4. คำแนะนำทั่วไปเกี่ยวกับชีววิทยาโมเลกุล
5. การควบคุมภายใน
6. บรรณานุกรม

1. การจัดการสารเคมี

ปั่นเหวี่ยงหลอดรีเอเจนต์สั้นๆ ก่อนเปิด เพื่อป้องกันการเกิดละอองลอย แบ่งรีเอเจนต์เป็นส่วนๆ เพื่อป้องกันการแช่แข็ง-ละลายหลายครั้งและการปนเปื้อนของสารตั้งต้น ติดฉลากและลงวันที่หลอดรีเอเจนต์และหลอดปฏิกิริยาทั้งหมดอย่างชัดเจน และบันทึกหมายเลขล็อตและชุดรีเอเจนต์ที่ใช้ในการทดลองทั้งหมด ปิเปตรีเอเจนต์และตัวอย่างทั้งหมดโดยใช้หัวกรอง ก่อนซื้อ ขอแนะนำให้ยืนยันกับผู้ผลิตว่าหัวกรองนั้นเหมาะกับยี่ห้อของปิเปตที่จะใช้หรือไม่

2. การจัดวางพื้นที่ทำงานและอุปกรณ์

ควรจัดพื้นที่ทำงานให้เป็นระเบียบเพื่อให้มั่นใจว่ากระบวนการทำงานดำเนินไปในทิศทางเดียวกัน ตั้งแต่บริเวณที่สะอาด (ก่อน PCR) ไปจนถึงบริเวณที่สกปรก (หลัง PCR) ข้อควรระวังทั่วไปต่อไปนี้จะช่วยลดโอกาสการปนเปื้อน ควรมีห้องแยกกัน หรืออย่างน้อยต้องมีพื้นที่แยกกันทางกายภาพ สำหรับการเตรียมมาสเตอร์มิกซ์ การสกัดกรดนิวคลีอิก และการเติมแม่แบบดีเอ็นเอ การขยายและการจัดการผลิตภัณฑ์ที่ขยายแล้ว และการวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ เช่น การวิเคราะห์ด้วยเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส

ในบางพื้นที่ การมีห้องแยกกัน 4 ห้องเป็นเรื่องยาก ทางเลือกที่เป็นไปได้แต่ไม่พึงปรารถนาคือการเตรียมมาสเตอร์มิกซ์ในพื้นที่กักเก็บตัวอย่าง เช่น ตู้เก็บตัวอย่างแบบลามินาร์โฟลว์ ในกรณีของการขยายพันธุ์ PCR แบบซ้อน การเตรียมมาสเตอร์มิกซ์สำหรับปฏิกิริยารอบที่สองควรเตรียมในพื้นที่ "สะอาด" สำหรับการเตรียมมาสเตอร์มิกซ์ แต่การเพาะเชื้อด้วยผลิตภัณฑ์ PCR ขั้นต้นควรทำในห้องกักเก็บตัวอย่าง และหากเป็นไปได้ในพื้นที่กักเก็บตัวอย่างเฉพาะ (เช่น ตู้เก็บตัวอย่างแบบลามินาร์โฟลว์)

แต่ละห้อง/พื้นที่ต้องมีชุดปิเปต ฟิลเตอร์ทิป ชั้นวางหลอดทดลอง วอร์เท็กซ์ เครื่องหมุนเหวี่ยง (ถ้ามี) ปากกา น้ำยาสำหรับห้องปฏิบัติการทั่วไป เสื้อคลุมห้องปฏิบัติการ และกล่องถุงมือแยกกัน โดยจะต้องเก็บไว้ที่จุดปฏิบัติงานของตนเอง ต้องล้างมือและเปลี่ยนถุงมือและเสื้อคลุมห้องปฏิบัติการเมื่อเคลื่อนย้ายระหว่างพื้นที่ที่กำหนด ไม่ควรเคลื่อนย้ายน้ำยาและอุปกรณ์จากพื้นที่สกปรกไปยังพื้นที่สะอาด หากเกิดกรณีร้ายแรงที่ต้องเคลื่อนย้ายน้ำยาหรืออุปกรณ์กลับด้าน จะต้องทำการฆ่าเชื้อด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 10% ก่อน แล้วจึงเช็ดทำความสะอาดด้วยน้ำสะอาด

บันทึก

ต้องเตรียมสารละลายโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 10% ใหม่ทุกวัน เมื่อใช้สำหรับการฆ่าเชื้อ ควรทิ้งเวลาสัมผัสอย่างน้อย 10 นาที
นอกจากนี้ ผลิตภัณฑ์ที่มีจำหน่ายในท้องตลาดซึ่งได้รับการตรวจสอบว่าเป็นสารฆ่าเชื้อพื้นผิวที่ทำลาย DNA สามารถใช้ได้หากคำแนะนำด้านความปลอดภัยในพื้นที่ไม่อนุญาตให้ใช้โซเดียมไฮโปคลอไรต์ หรือหากโซเดียมไฮโปคลอไรต์ไม่เหมาะสมสำหรับการกำจัดสารปนเปื้อนในส่วนโลหะของอุปกรณ์

ตามหลักการแล้ว เจ้าหน้าที่ควรปฏิบัติตามหลักการทำงานแบบทิศทางเดียว และไม่ย้ายจากพื้นที่สกปรก (หลัง PCR) กลับไปยังพื้นที่สะอาด (ก่อน PCR) ในวันเดียวกัน อย่างไรก็ตาม อาจมีบางกรณีที่หลีกเลี่ยงไม่ได้ เมื่อเกิดเหตุการณ์เช่นนี้ขึ้น เจ้าหน้าที่ต้องล้างมือให้สะอาด เปลี่ยนถุงมือ สวมเสื้อคลุมห้องปฏิบัติการที่กำหนดให้ และไม่นำอุปกรณ์ใดๆ ที่ต้องการนำออกจากห้องอีก เช่น หนังสือคู่มือปฏิบัติการ ควรเน้นย้ำมาตรการควบคุมเหล่านี้ในการฝึกอบรมเจ้าหน้าที่เกี่ยวกับวิธีการทางโมเลกุล

หลังการใช้งาน ควรทำความสะอาดพื้นที่ทำงานด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 10% (ตามด้วยน้ำปราศจากเชื้อเพื่อกำจัดสารฟอกขาวที่ตกค้าง) เอทานอล 70% หรือสารฆ่าเชื้อทำลายดีเอ็นเอที่ได้รับการรับรองและมีจำหน่ายในท้องตลาด ควรติดตั้งหลอดอัลตราไวโอเลต (UV) เพื่อให้สามารถฆ่าเชื้อด้วยการฉายรังสีได้ อย่างไรก็ตาม การใช้หลอด UV ควรจำกัดเฉพาะในพื้นที่ทำงานปิด เช่น ตู้เซฟ เพื่อจำกัดการสัมผัสรังสี UV ของเจ้าหน้าที่ห้องปฏิบัติการ โปรดปฏิบัติตามคำแนะนำของผู้ผลิตเกี่ยวกับการดูแล การระบายอากาศ และการทำความสะอาดหลอด UV เพื่อให้มั่นใจว่าหลอด UV ยังคงมีประสิทธิภาพ

หากใช้เอธานอล 70% แทนโซเดียมไฮโปคลอไรต์ จะต้องฉายแสง UV เพื่อทำการฆ่าเชื้อให้เสร็จสมบูรณ์
ห้ามทำความสะอาดวอร์เท็กซ์และเครื่องเหวี่ยงด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ แต่ให้เช็ดด้วยเอทานอล 70% แล้วนำไปฉายแสงยูวี หรือใช้น้ำยาฆ่าเชื้อทำลายดีเอ็นเอที่มีจำหน่ายตามท้องตลาด สำหรับคราบหก โปรดติดต่อผู้ผลิตเพื่อขอคำแนะนำเพิ่มเติมในการทำความสะอาด หากคำแนะนำของผู้ผลิตอนุญาต ควรฆ่าเชื้อปิเปตด้วยหม้ออัดไอน้ำเป็นประจำ หากไม่สามารถฆ่าเชื้อปิเปตด้วยหม้ออัดไอน้ำได้ ให้ใช้น้ำยาฆ่าเชื้อทำลายดีเอ็นเอที่มีจำหน่ายตามท้องตลาด แล้วนำไปฉายแสงยูวี

การทำความสะอาดด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ที่มีเปอร์เซ็นต์สูงอาจทำให้พลาสติกและโลหะของปิเปตเสียหายได้ในที่สุด หากทำเป็นประจำ ควรตรวจสอบคำแนะนำจากผู้ผลิตก่อน อุปกรณ์ทุกชิ้นต้องได้รับการสอบเทียบอย่างสม่ำเสมอตามกำหนดเวลาที่ผู้ผลิตแนะนำ ควรมีเจ้าหน้าที่ที่ได้รับมอบหมายรับผิดชอบดูแลให้ปฏิบัติตามกำหนดเวลาสอบเทียบ บันทึกรายละเอียด และแสดงฉลากบริการอย่างชัดเจนบนอุปกรณ์

3. คำแนะนำการใช้และการทำความสะอาดสำหรับพื้นที่โมเลกุลที่กำหนด

ก่อนการทำ PCR: การเตรียมรีเอเจนต์แบบแบ่งส่วน/มาสเตอร์มิกซ์: บริเวณนี้ควรเป็นพื้นที่ที่สะอาดที่สุดในบรรดาพื้นที่ทั้งหมดที่ใช้สำหรับการเตรียมการทดลองระดับโมเลกุล และควรเป็นตู้ลามินาร์โฟลว์ที่จัดเตรียมไว้โดยเฉพาะ พร้อมติดตั้งไฟยูวี ห้ามเคลื่อนย้ายตัวอย่าง กรดนิวคลีอิกที่สกัดแล้ว และผลิตภัณฑ์ PCR ที่ผ่านการขยายสัญญาณในบริเวณนี้ ควรเก็บรีเอเจนต์สำหรับการขยายสัญญาณไว้ในช่องแช่แข็ง (หรือตู้เย็น ตามคำแนะนำของผู้ผลิต) ในพื้นที่ที่กำหนดไว้ โดยควรอยู่ติดกับตู้ลามินาร์โฟลว์หรือพื้นที่ก่อนการทำ PCR ควรเปลี่ยนถุงมือทุกครั้งที่เข้าสู่พื้นที่ก่อนการทำ PCR หรือตู้ลามินาร์โฟลว์

ควรทำความสะอาดพื้นที่ก่อนการทำ PCR หรือตู้เก็บตัวอย่างแบบลามินาร์โฟลว์ก่อนและหลังการใช้งาน ดังนี้ เช็ดอุปกรณ์ทั้งหมดในตู้เก็บตัวอย่าง เช่น ปิเปต กล่องทิป วอร์เท็กซ์ เครื่องหมุนเหวี่ยง ชั้นวางหลอดทดลอง ปากกา ฯลฯ ด้วยเอทานอล 70% หรือสารฆ่าเชื้อทำลายดีเอ็นเอเชิงพาณิชย์ แล้วปล่อยให้แห้ง ในกรณีที่เป็นพื้นที่ทำงานแบบปิด เช่น ตู้เก็บตัวอย่างแบบลามินาร์โฟลว์ ให้นำเครื่องดูดควันไปฉายแสงยูวีเป็นเวลา 30 นาที

บันทึก

อย่าให้น้ำยาสัมผัสกับแสงยูวี ให้ย้ายเข้าตู้เมื่อทำความสะอาดแล้วเท่านั้น หากทำ reverse transcription PCR การเช็ดพื้นผิวและอุปกรณ์ด้วยสารละลายที่สามารถสลาย RNases เมื่อสัมผัสก็อาจเป็นประโยชน์ ซึ่งอาจช่วยป้องกันผลลบปลอมจากการย่อยสลาย RNA ด้วยเอนไซม์ หลังจากขจัดสารปนเปื้อนและก่อนเตรียมมาสเตอร์มิกซ์ ควรเปลี่ยนถุงมืออีกครั้ง จากนั้นตู้ก็พร้อมใช้งาน

Pre-PCR: การสกัดกรดนิวคลีอิก/การเติมเทมเพลต:

กรดนิวคลีอิกต้องถูกสกัดและจัดการในพื้นที่ที่กำหนดเป็นพื้นที่ที่สอง โดยใช้ชุดปิเปต ปลายกรอง ชั้นวางหลอดทดลอง ถุงมือใหม่ เสื้อคลุมแล็บ และอุปกรณ์อื่นๆ แยกต่างหาก พื้นที่นี้ยังใช้สำหรับการเพิ่มแม่แบบ ตัวควบคุม และเส้นแนวโน้มลงในหลอดหรือแผ่นมาสเตอร์มิกซ์ เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของตัวอย่างกรดนิวคลีอิกที่สกัดได้ที่กำลังวิเคราะห์ ขอแนะนำให้เปลี่ยนถุงมือก่อนจัดการกับตัวควบคุมเชิงบวกหรือมาตรฐาน และใช้ชุดปิเปตแยกต่างหาก ห้ามปิเปตรีเอเจนต์ PCR และผลิตภัณฑ์ที่เพิ่มปริมาณแล้วในพื้นที่นี้ ควรเก็บตัวอย่างไว้ในตู้เย็นหรือช่องแช่แข็งที่กำหนดไว้ในพื้นที่เดียวกัน พื้นที่ทำงานของตัวอย่างควรได้รับการทำความสะอาดเช่นเดียวกับพื้นที่มาสเตอร์มิกซ์

หลัง PCR: การขยายและการจัดการผลิตภัณฑ์ที่ขยาย

พื้นที่ที่กำหนดนี้ใช้สำหรับกระบวนการหลังการขยายสัญญาณ และควรแยกออกจากพื้นที่ก่อนการทำ PCR โดยทั่วไปจะมีเครื่องเทอร์โมไซเคิลและแพลตฟอร์มแบบเรียลไทม์ และควรมีตู้แบบลามินาร์โฟลว์สำหรับเติมผลิตภัณฑ์ PCR รอบที่ 1 ลงในปฏิกิริยารอบที่ 2 หากมีการทำ PCR แบบซ้อน ห้ามจัดการรีเอเจนต์ PCR และกรดนิวคลีอิกที่สกัดแล้วในพื้นที่นี้เนื่องจากมีความเสี่ยงสูงต่อการปนเปื้อน พื้นที่นี้ควรมีถุงมือ เสื้อคลุมห้องปฏิบัติการ ชั้นวางจานและหลอดทดลอง ปิเปต ปลายกรอง ถัง และอุปกรณ์อื่นๆ แยกต่างหาก ต้องปั่นหลอดทดลองก่อนเปิด ควรทำความสะอาดพื้นที่ทำงานตัวอย่างเช่นเดียวกับพื้นที่มาสเตอร์มิกซ์

หลัง PCR: การวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์

ห้องนี้ใช้สำหรับอุปกรณ์ตรวจจับผลิตภัณฑ์ เช่น ถังเจลอิเล็กโทรโฟเรซิส ชุดจ่ายไฟ เครื่องฉายแสงยูวี และระบบบันทึกข้อมูลเจล พื้นที่นี้ควรมีถุงมือ เสื้อคลุมแล็บ ชั้นวางจานและหลอดทดลอง ปิเปต ปลายกรอง ถังเก็บ และอุปกรณ์อื่นๆ แยกกัน ห้ามนำสารเคมีชนิดอื่นเข้ามาในพื้นที่นี้ ยกเว้นสีย้อมสำหรับบรรจุสาร เครื่องหมายโมเลกุล เจลอะกาโรส และส่วนประกอบบัฟเฟอร์ ควรทำความสะอาดพื้นที่ทำงานของตัวอย่างด้วยวิธีเดียวกับพื้นที่มาสเตอร์มิกซ์

หมายเหตุสำคัญ

ตามหลักการแล้ว ไม่ควรเข้าห้องก่อน PCR ในวันเดียวกัน หากมีการปฏิบัติงานในห้องหลัง PCR ไปแล้ว หากหลีกเลี่ยงไม่ได้โดยสิ้นเชิง โปรดตรวจสอบให้แน่ใจว่าได้ล้างมือให้สะอาดก่อน และสวมเสื้อคลุมห้องปฏิบัติการเฉพาะในห้องนั้น ห้ามนำหนังสือและเอกสารห้องปฏิบัติการเข้าไปในห้องก่อน PCR หากเคยใช้ในห้องหลัง PCR แล้ว หากจำเป็น ให้ถ่ายเอกสารโปรโตคอล/รหัสตัวอย่าง ฯลฯ ออกมาซ้ำ

4. คำแนะนำทั่วไปเกี่ยวกับชีววิทยาโมเลกุล

สวมถุงมือชนิดไม่มีแป้งเพื่อป้องกันการยับยั้งการทดสอบ เทคนิคการปิเปตที่ถูกต้องเป็นสิ่งสำคัญยิ่งในการลดการปนเปื้อน การปิเปตที่ไม่ถูกต้องอาจทำให้เกิดการกระเด็นขณะจ่ายของเหลวและเกิดละอองลอย แนวทางปฏิบัติที่ดีสำหรับการปิเปตอย่างถูกต้องสามารถดูได้จากลิงก์ต่อไปนี้: คู่มือการปิเปตของ Gilson, วิดีโอเทคนิคการปิเปตของ Anachem, หลอดเหวี่ยงก่อนเปิด และเปิดอย่างระมัดระวังเพื่อป้องกันการกระเด็น ปิดหลอดทันทีหลังการใช้งานเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อน

เมื่อทำปฏิกิริยาหลายปฏิกิริยา ให้เตรียมมาสเตอร์มิกซ์หนึ่งชุดที่มีรีเอเจนต์ทั่วไป (เช่น น้ำ, dNTPs, บัฟเฟอร์, ไพรเมอร์ และเอนไซม์) เพื่อลดจำนวนการถ่ายโอนรีเอเจนต์และลดความเสี่ยงของการปนเปื้อน ขอแนะนำให้ตั้งมาสเตอร์มิกซ์บนน้ำแข็งหรือบล็อกเย็น การใช้เอนไซม์ Hot Start อาจช่วยลดการผลิตผลิตภัณฑ์ที่ไม่จำเพาะ ควรป้องกันรีเอเจนต์ที่มีหัววัดฟลูออเรสเซนต์จากแสงเพื่อป้องกันการเสื่อมสภาพ

5. การควบคุมภายใน

ระบุชุดควบคุมเชิงบวกและเชิงลบที่ได้รับการยืนยันและมีลักษณะเฉพาะอย่างชัดเจน พร้อมด้วยชุดควบคุมแบบไม่มีเทมเพลตในทุกปฏิกิริยา และเส้นแนวโน้มไทเทรตแบบหลายจุดสำหรับปฏิกิริยาเชิงปริมาณ ชุดควบคุมเชิงบวกไม่ควรมีความเข้มข้นสูงจนก่อให้เกิดความเสี่ยงต่อการปนเปื้อน ระบุชุดควบคุมการสกัดเชิงบวกและเชิงลบเมื่อทำการสกัดกรดนิวคลีอิก

ขอแนะนำให้ติดประกาศคำแนะนำที่ชัดเจนในแต่ละพื้นที่ เพื่อให้ผู้ใช้งานทราบถึงกฎการปฏิบัติตน ห้องปฏิบัติการวินิจฉัยที่ตรวจพบ DNA หรือ RNA ในระดับต่ำมากในตัวอย่างทางคลินิก อาจต้องการใช้มาตรการรักษาความปลอดภัยเพิ่มเติม โดยจัดให้มีระบบจัดการอากาศแยกกัน โดยมีแรงดันอากาศบวกเล็กน้อยในห้องก่อน PCR และแรงดันอากาศลบเล็กน้อยในห้องหลัง PCR

สุดท้ายนี้ การพัฒนาแผนการประกันคุณภาพ (QA) จะเป็นประโยชน์ แผนดังกล่าวควรประกอบด้วยรายการสต็อกน้ำยาหลักและสต็อกน้ำยาสำรอง กฎเกณฑ์การจัดเก็บชุดอุปกรณ์และน้ำยา การรายงานผลการควบคุม โปรแกรมการฝึกอบรมพนักงาน อัลกอริทึมการแก้ไขปัญหา และมาตรการแก้ไขเมื่อจำเป็น

6. บรรณานุกรม

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. บทที่ 3: การจัดตั้งห้องปฏิบัติการ qPCR เอกสารแนะนำสำหรับการทดสอบแหล่งน้ำเพื่อการพักผ่อนหย่อนใจโดยใช้วิธี USEPA qPCR 1611 มหาวิทยาลัย Lansing-Michigan State

Public Health England, NHS มาตรฐานของสหราชอาณาจักรสำหรับการตรวจสอบทางจุลชีววิทยา: แนวปฏิบัติที่ดีในห้องปฏิบัติการเมื่อทำการทดสอบการขยายโมเลกุล) คำแนะนำด้านคุณภาพ 2013;4(4):1–15

Mifflin T. การจัดตั้งห้องปฏิบัติการ PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.

Schroeder S 2013. การบำรุงรักษาเครื่องเหวี่ยงตามปกติ: การทำความสะอาด การบำรุงรักษา และการฆ่าเชื้อเครื่องเหวี่ยง โรเตอร์ และอะแดปเตอร์ (เอกสารเผยแพร่ฉบับที่ 14) ฮัมบูร์ก: เอปเพนดอร์ฟ; 2013.

Viana RV, Wallis CL. แนวปฏิบัติทางห้องปฏิบัติการทางคลินิกที่ดี (GCLP) สำหรับการทดสอบระดับโมเลกุลที่ใช้ในห้องปฏิบัติการวินิจฉัย ใน: Akyar I, บรรณาธิการ. ขอบเขตกว้างของการควบคุมคุณภาพ ริเยกา, โครเอเชีย: Intech; 2011: 29–52